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提纯线粒体的呼吸测定

添加时间:[2015-12-17] 来源: 浏览次数:59127

在提纯的线粒体样品中加入琥珀酸盐+鱼藤酮或者只有琥珀酸盐作为底物。实验目的评估(1)氧化磷酸化(OXPHOS)能力和呼吸抑制状态,分别为偶联情况下ADP刺激的呼吸状态和ADP磷酸化生成ATP后的呼吸抑制状态(分别为P状态与L状态;检查ADP非饱和或者细胞色素C缺失带来的限制);(2)解偶联状态下的电子传递(ETS)能力(称为E状态;FCCP滴定,要避免高浓度FCCP引起的抑制作用);(3)氧化磷酸化的偶联控制(如果氧化磷酸化系统受限,传统RCR忽视了这种情况)。


S(Rot)N (L):在没有腺甘酸的情况下,加入10mM琥珀酸盐诱导第一个静息或泄漏状态。

S(Rot)D0.25(状态3:高ADP):加入0.25mM ADP后,D0.25,氧耗量明显达到最大值(状态3,但是ADP未饱和)。

S(Rot)T (L; 状态4:ADP磷酸化为ATP):因ADP磷酸化为ATP,呼吸恢复到静息状态(T)。

S(Rot)TD0.25(状态3:高ADP):充氧后,再加入0.25mM的ADP,此时同时有0.25mM的ATP。第2个流量峰值高于第1个,是因为琥珀酸脱氢酶的激活。

S(Rot)TD(P;状态3:饱和的ADP):达到最大流量后,立刻再加入0.25mM ADP来判断ADP是否饱和,并观察时间和氧耗量的关系,以评估氧化磷酸化能力(P)。

Sc(Rot)TD(检测细胞色素C):加入10uM细胞色素C检测线粒体外膜的完整性。细胞色素C的刺激将损伤线粒体外膜而限制呼吸,为Sc(Rot)TD。

Sc(Rot)E(解耦偶联E状态;ETS):接着用微量注射泵TIP2k逐步滴定0.5uM的解偶联剂FCCP。观察在状态P的基础上(Sc(Rot)TD,ADP饱和)氧流量的增加。如果磷酸化系统(ANT,ATP合酶,磷酸转运蛋白)限制氧化磷酸化能力,那么解偶联剂刺激会达到最大的电子传递能力。本实验中状态E是参考值,其ROX-修正后的流量值为285.9pmol·s-1·ml-1(见图1)。

Sc(RotAma)u(由于氧化反应副作用导致的残余氧消耗;ROX)最后,加入复合体Ⅲ的抑制剂抗霉素A(Ama)降低解偶联线粒体的呼吸,以评估氧化反应的副作用导致的残余氧消耗,这一氧消耗可以通过氰化物进一步抑制。


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