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组织匀浆的呼吸测定

添加时间:[2015-12-17] 来源: 浏览次数:59126

取出动物组织,通过匀浆机或者研磨的方法使组织匀浆。分离的组织需要部分透化细胞膜(骨骼肌)或者完全透化细胞膜(心肌,肝脏组织)。如果要研究细胞的正常呼吸和内源性呼吸就不要透化细胞。如果需要透化就需加入化合物(saponin皂苷或者digitonin毛地黄皂苷),经过标准的孵育步骤后将破坏线粒体的内膜和外膜。

通过复杂的底物-解偶联剂-抑制剂滴定实验研究透化的肌纤维的呼吸态,进行了一项复杂的底物-解偶联剂-抑制剂滴定方案。逐步滴定都会产生定义好的呼吸状态。

1.  CI关联的的LEAK 呼吸抑制状态,L:非磷酸化的静止状态,有复合体I的底物(CI,谷氨酸盐+苹果酸盐;GML;没有腺苷酸,N)。

2.  CI关联的氧化磷酸化能力,P:ADP饱和刺激的呼吸,ADP和CI关联的底物(GMP)诱发的活跃的偶联状态(部分偶联或原有的解偶联)。

3. 测试细胞色素C作为质量管理:进一步滴定细胞色素C,测试线粒体外膜的完整性(呼吸的诱发表示细胞色素C的缺失;(GMcp))。

4. CI+ CII关联的氧化磷酸化能力,P:复合体Ⅱ底物琥珀酸盐的加入,激发了复合体Ⅰ+ Ⅱ的电子流通过辅酶Q,可作为生理条件下氧化磷酸化能力的估计值(GMSP;Gnaiger 2009)。

5. CI+ II-关联的电子传递能力,E:解偶联剂(FCCP)逐步滴定以获得非偶联状态的最大氧消耗(GMSE;避免高浓度FCCP产生的抑制),根据电子传递能力测试磷酸化系统对氧化磷酸化的限制作用。

6. CII关联的电子传递能力,E:用鱼藤酮(Rot)抑制CI后,只剩下琥珀酸盐支持电子传递系统,S(Rot)E。

7. 加入抗霉素A(复合体Ⅲ的抑制剂)和其他电子传递抑制剂后,评价了透化的肌纤维中残余氧消耗(ROX)。

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